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SILAC定量蛋白质组学技术

2020-03-06 09:44 发布人:系统

SILAC (Stable isotope labeling with aminoacids in cellculture) 即细胞培养条件下稳定同位素标记技术,其基本原理是在细胞培养时,采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养(常用稳定同位素氨基酸Lys和Arg)。在细胞传代培养过程中,同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质,细胞经传代培养5-6代后,细胞的所有蛋白质将被同位素标记,等量混合标记的蛋白质后经过分离和质谱分析,通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量,同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。由于SILAC标记技术是体内标记技术,几乎不影响细胞的功能,因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用。

iTRAQ (Isobaric tag for relative and absolutequantitation)和Tandem mass tags(TMT)是目前应用最广泛的两大类化学标记定量技术,其原理一样,区别在于分别由AB和Thermo公司开发销售。简单来说,iTRAQ、TMT技术的原理是依赖于肽段末端不同的同位素标记以区分样品,二维色谱有效分离,对标记试剂所携带的报告离子强度进行计算以匹配对应肽段量,整合各定量肽段的信息以得出蛋白整体变化趋势。

应用领域:

1、功能蛋白质筛选;
2、疾病标志物筛选;
3、药物作用靶点研究 。

 

技术优点:
1 高通量,可同时鉴定并定量数千种蛋白质;   
2 定量精确,线性定量范围广,降低由于样品制备不同而造成的实验差异;
3 相容性高,可以对在DMEM、DMEM-F12、1640三种培养基中培养的多种细胞进行标记;
4 标记采用的是体内标记技术,标记效率可高达100%,且更接近样品真实状态。

可选质谱仪器
Orbitrap Fusion/ Q Exactive HF / Q Exactive Plus /Q Exactive
SILAC技术流程:

可选择数据分析
1.蛋白质/肽段鉴定及定量结果
2.差异蛋白质统计分析
3.蛋白质Pathway通路分析及差异
  蛋白的Pathway通路分析
4.多样品间分类统计、功能富集、
  聚类分析(适用于样本数≥3的项目)

样品要求:
蛋白提取物:浓度>1ug/ul,蛋白质总量>300ug
细胞样品:≥107