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快速非标定量磷酸化蛋白质组检测

2020-03-05 16:02 发布人:系统

在酸性条件下(pH约为2),TiO2带正电荷,可与肽样品中具有磷酸化修饰的肽片段上的带负电荷的磷酸基团特异性结合,经清洗缓冲液清洗去除非磷酸化肽片段后,用碱性洗脱液(pH约为11),将结合于TiO2上的磷酸化肽洗脱下来,从而达到特异性富集磷酸化肽的目的。为最大限度排除肽混合物中带负电荷的酸性非磷酸化肽与TiO2非特异结合带来的干扰,会在酸性的TiO2富集结合缓冲液中加入2,5-二羟基苯甲酸或乳酸。磷酸化肽富集完成后,利用液相色谱-串联质谱对其进行检测。

应用领域:
1.不同实验条件下磷酸化蛋白质组变化及信号通路分析;
2.筛选特定蛋白激酶的磷酸化蛋白底物。

技术优点:
1.独特的TiO2富集结合缓冲液配方,可特异性富集细胞和组织中95%磷酸化蛋白;
2.可在5小时完成1个样品的检测,覆盖8000-10000磷酸化肽(约3000-4000蛋白),适合对多样品进行高通量分析;
3.可进行定量比较分析。

可选仪器:
QExactive HF、Orbitrap Fusion

分析流程
样品经Trypsin 酶切后脱盐,用TiO2富集磷酸肽,将TiO2富集的磷酸肽洗脱并分成3个组分,分别经液相色谱-串联质谱分析,采用Mascot等软件对质谱数据进行分析,确定磷酸化位点和定量分析。

可选数据分析
1.磷酸化肽的鉴定及定量;
2.磷酸化肽及蛋白的GO分析及差异蛋白GO分析;
3.磷酸化肽及蛋白的Pathway通路分析及差异蛋白的Pathway通路分析;
4.重复性分析(仅针对有重复设计的项目);
5.多样品间表达模式聚类分析(适用于样本数≥3的项目)。

样品要求
蛋白提取物:≥2mg
细胞:≥107
组织:动物组织≥100mg,植物组织≥100 mg
体液:血清≥20μL,脑脊液≥30μL